溶液配制：

　　Honda buffer：

　　25 mM Tris-HCl(pH7.4)

　　10 mM MgCl2

　　2.5% (wt/vol) Ficoll 400

　　5% (wt/vol) Dextran T 40

　　0.4 M蔗糖

　　1x Protease Inhibitor Cocktail (用前加)

　　5 mM DTT (用前加)

　　10 mM β-巰基乙醇 (用前加)

　　Triton X-100：20% (vol/vol)

　　試劑及耗材：

　　Triton X-100：#T8787, Sigma, St. Louis, USA

　　蛋白酶抑制劑(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets): #11836145001, Roche, Mannheim, Germany

　　二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol, DTT): AMRESCO, Solon, USA

　　Ficoll 400: #F4375，Sigma，St. Louis，USA

　　Dextran T40: #17-0270-01, GE Healthcare, Little Chalfont, England

　　UGPase抗體: #AS05086, Agrisera, Vännäs, Sweden

　　Histone H3抗體: #AS10710, Agrisera, Vännäs, Sweden

　　Miracloth濾布: #475855-1R，Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Germany

　　實(shí)驗(yàn)流程：

　　1. 稱取2 g 10日齡的擬南芥幼苗于液氮中研磨。

　　2. 將樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，并加入4 mL Honda buffer，顛倒混勻后置于冰上10 min，使其充分溶解。

　　3. 用Miracloth濾布對樣品進(jìn)行過濾。

　　4. 在濾液中加入終濃度為0.5%的Triton X-100。充分混勻后冰上放置15 min。

　　5. 取出100 μL樣品作為總蛋白(Total protein)。

　　6. 4℃，離心1500 g，5 min。轉(zhuǎn)移上清至新管，作為去除了核的細(xì)胞質(zhì)組分蛋白(Nuclei-depleted fraction)。再重復(fù)離心2次，去除沉淀。

　　7. 沉淀用1 mL添加了0.1% Triton X-100的Honda buffer進(jìn)行清洗，洗5次，1500 g，離心5 min。

　　8. 沉淀用Honda buffer重懸，50 g，離心1 min，以去除細(xì)胞碎片，細(xì)胞壁及淀粉粒等組分。并將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管。

　　9. 1800 g，離心5 min，收集的沉淀即為核組分(Nuclei-enriched fraction)。將沉淀溶于100 μL Honda buffer中。

　　10. 將總蛋白、胞質(zhì)組分和核組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western blot檢測分離效果。

　　11. Western blot所用抗體：細(xì)胞質(zhì)組分特異的UGPase抗體(1 : 500稀釋)及核組分特異的Histone H3抗體(1 :5000稀釋)對同時對各組分進(jìn)行檢測。

　　結(jié)果示例：

　　引自ref.3

　　參考文獻(xiàn)：

　　1. Kinkema et al., Nuclear Localization of NPR1 Is Required for Activation ofPRGene Expression, The Plant Cell (2020) 12:2339–235

　　2.Xia et al., Developmental and hormonal regulation of the Arabidopsis CER2 gene that codes for a nuclear-localized protein required for the normal accumulation of cuticular caxes, Plant Physiology (1997) 115:925-937

　　3. Long et al., BICELLULAR POLLEN 1 is a modulator of DNA replication and pollen development in Arabidopsis, New Phytologist (2019) 222: 588–603